Ondřej Mazuch, que actúa de defensa central, empezó su carrera futbolística en las categorías inferiores del FC Brno. En 2006 pasó a formar parte de la primera plantilla del club.

El 2 de junio de 2007 fichó por la ACF Fiorentina italiano, equipo que tuvo que realizar un desembolso económico de 2,8 millones de euros para poder hacerse con sus servicios. Debutó con su nueva camiseta el 11 de diciembre en un partido de la Copa de Italia contra el Ascoli Calcio.